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大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞永生化細胞操作步驟

點擊次數(shù):231 更新時間:2025-05-15

大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞永生化細胞操作步驟

** 細胞轉(zhuǎn)染與篩選**

完成細胞培養(yǎng)和預(yù)處理后,將構(gòu)建好的SV40大T抗原表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入原代Müller細胞。轉(zhuǎn)染48小時后,更換為含400μg/mL G418的選擇培養(yǎng)基進行抗性篩選,持續(xù)2-3周直至未轉(zhuǎn)染細胞死亡。期間需每3天更換一次篩選培養(yǎng)基,并密切觀察細胞狀態(tài)。注意設(shè)置未轉(zhuǎn)染細胞作為陰性對照,以確認篩選效果。

**單克隆分離與擴增**

采用有限稀釋法進行單克隆分離:將篩選后的細胞懸液稀釋至0.5個細胞/100μL,接種于96孔板,每孔加入100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)1周后標記單個細胞形成的克隆,待克隆長至孔底50%面積時,用克隆環(huán)法分離并轉(zhuǎn)移至24孔板擴大培養(yǎng)。此過程需特別注意無菌操作,建議每個克隆保留3個備份。

**永生化驗證**

通過以下方法驗證細胞永生化特性:

1) RT-PCR檢測SV40大T抗原mRNA表達;

2) Western blot檢測大T抗原蛋白表達;

3) 連續(xù)傳代觀察:永生化細胞應(yīng)能穩(wěn)定增殖超過50代,而原代細胞通常在10代左右出現(xiàn)衰老;

4) 生長曲線測定:繪制細胞倍增時間曲線,永生化細胞應(yīng)保持穩(wěn)定增殖速率。

** 功能特性鑒定**

為確保永生化細胞保持Müller細胞特性,需進行:

• 免疫熒光染色檢測特異性標志物(GS、CRALBP、Vimentin)

• 合成酶活性測定

• 鉀離子緩沖功能檢測

• 對視網(wǎng)膜神經(jīng)元條件培養(yǎng)基的反應(yīng)性測試

**細胞凍存與復(fù)蘇**

鑒定合格的細胞系按1×10^6細胞/mL密度凍存于含10%DMSO的培養(yǎng)基中,程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮保存。復(fù)蘇時采用37℃快速水浴法,離心去除凍存液后重懸于新鮮培養(yǎng)基。建議前3代細胞每代凍存5-10支備份。

**注意事項**

1. 所有操作需在二級生物安全柜中進行

2. 不同批次血清需預(yù)先進行細胞生長測試

3. 定期檢測支原體污染

4. 建議使用低代次細胞(10-30代)進行實驗

5. 原始細胞株應(yīng)分開保存避免交叉污染


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